凡体表部位具有典型疱疹损害的单纯疱疹诊断不难；对损害仅存在于腔道深处者，如生殖道、呼吸道、直肠的患者，倘疏于全面仔细的体检，则有可能误诊。
对仅系内脏疱疹损害，而身体浅表等易暴露部局限性损害，或呈脑组织弥漫性病变，CT和MR等影像学检查显示有额、颞叶的软化灶。
双份血清和脑脊液HSV抗体检查有显著变化趋势；病原学检查阳性，如PCR检测脑脊液提示有HSV感染等。应注意的是，流行病学资料有时并不一定能收集到。
例如，在部分新生儿HSV感染者的生母中。并无单纯疱疹发病史或明确的接触史，从而给临床诊断造成很大困难。此类疑难病例的确诊有赖于采集临床标本，甚至活组织检查，以搜索单纯疱疹病毒感染存在的证据。疑新生儿及患有宫内HSV感染者，血清IgM型HSV抗体检测阳性即可确诊。
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